Fotodegradacja ofloksacyny – wpływ na skuteczność i środowisko

Dlaczego OFLX budzi zainteresowanie w okulistyce i środowisku?

Ofloksacyna (OFLX) jest drugim najczęściej sprzedawanym antybiotykiem z grupy fluorochinolonów w USA po cyprofloksacynie, z 1 963 627 receptami wystawionymi w 2022 roku, a także najpopularniejszym lekiem przeciwinfekcyjnym stosowanym w okulistyce z 35% i 67% udziałem w rynku odpowiednio w preparatach okulistycznych i optycznych. OFLX znajduje się na Liście Leków Niezbędnych Światowej Organizacji Zdrowia w sekcji preparatów okulistycznych. Jako fluorochinolon drugiej generacji, OFLX ma szerokie spektrum działania nie tylko przeciwko bakteriom Gram-ujemnym, ale także Gram-dodatnim. Jest stosowany głównie w postaci kropli do oczu i uszu, choć dostępna jest również forma doustna. OFLX jest całkowicie eliminowany przez nerki i, podobnie jak większość leków, trafia do środowiska poprzez ścieki komunalne, gdzie wykrywano go w stężeniach dochodzących do 11,7 µg/L w wodach powierzchniowych w Chinach. Przy takich stężeniach OFLX może hamować wzrost wrażliwych mikroorganizmów, w tym sinic. Jeszcze bardziej niebezpiecznym efektem obecności antybiotyków w środowisku wodnym jest możliwość indukowania oporności mikroorganizmów na antybiotyki, co może być powodowane przez sub-mikrogramowe stężenia antybiotyków.

Fluorochinolony różnią się wrażliwością na fotodegradację indukowaną światłem UV-Vis. Badania wykazały, że ich rozkład zachodzi zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu, a szybkość fotodegradacji wzrasta w następującej kolejności: norfloksacyna < cyprofloksacyna < OFLX < moksyfloksacyna. Podczas gdy 90% degradacji danofloksacyny, cyprofloksacyny i enrofloksacyny osiągnięto w mniej niż 30 minut ekspozycji na pełne światło słoneczne, ten sam procent degradacji wymagał 120 i 240 minut ekspozycji dla lewofloksacyny (S-enancjomer OFLX) i moksyfloksacyny. OFLX był stabilny podczas 90-minutowego naświetlania światłem widzialnym. Fotodegradacja rzadko prowadzi do całkowitego rozkładu substancji. W przypadku OFLX zidentyfikowano kilka produktów podczas fotolizy i/lub fotokatalizy, najczęściej wynikających z bezpośredniej hydroksylacji lub hydroksylacji z otwarciem pierścienia.

Jak przeprowadzono badanie fotodegradacji OFLX?

Celem niniejszego badania była kompleksowa ocena fotodegradacji OFLX przy użyciu symulatora światła słonecznego SunTest CPS+. Aby ocenić wpływ formulacji na ten proces, testowano zarówno czysty antybiotyk, jak i komercyjne krople do oczu Floxal. Stężenie OFLX oceniano za pomocą HPLC z detektorem diodowym (HPLC-DAD), podczas gdy powstałe produkty wykrywano za pomocą UHPLC z wysokorozdzielczym spektrometrem masowym (HR MS/MS). Do oceny toksyczności zastosowano trzy bioassaye: MARA – test toksyczności przewlekłej z 10 gatunkami bakterii i 1 gatunkiem drożdży; Microtox® – test toksyczności ostrej z bakteriami luminescencyjnymi A. fischeri; oraz Spirotox – test toksyczności ostrej z pierwotniakiem S. ambiguum. Test MARA został użyty do oceny aktywności przeciwbakteryjnej fotoproduktów powstałych podczas procesu. Testy Microtox® i Spirotox zostały użyte do oceny, czy proces nie produkował produktów, które były ostro toksyczne dla innych organizmów.

OFLX, zarówno w czystym roztworze, jak i w postaci kropli do oczu Floxal, naświetlano w symulatorze światła słonecznego SunTest CPS+. Toksyczność nienaświetlanych roztworów i roztworów naświetlanych przez 30, 45, 60, 90 i 120 minut oceniano za pomocą testów MARA, Spirotox i Microtox®. Jednostki toksyczności obliczono dla najbardziej wrażliwych bakterii i porównano z toksycznością przewidywaną na podstawie stężeń OFLX mierzonych podczas naświetlania. Jednocześnie określono stężenie OFLX we wszystkich próbkach i podjęto próbę identyfikacji powstałych fotoproduktów.

Czy fotodegradacja OFLX zmienia jego toksyczność i aktywność antybakteryjną?

Test MARA oferuje unikalną możliwość jednoczesnej oceny toksyczności przewlekłej 11 szczepów mikroorganizmów. OFLX hamował wzrost bakterii D. acidovorans w stężeniach od 7,6 do 21,2 µg/L, przy czym Floxal był średnio dwa razy mniej toksyczny. Kolejne dwa szczepy bakterii Gram-ujemnych, Citrobacter freudii i Comamonas testosterone, były 5,2 do 8,0 razy mniej wrażliwe niż D. acidovorans, chociaż ich wartości MTC poniżej 100 µg/L również wskazują na wysoką wrażliwość tych szczepów bakterii na ten antybiotyk. Z kolei bakterie Gram-dodatnie Kurthia gibsonii, Microbacterium sp. i Staphylococcus warneri oraz Gram-ujemne Pseudomonas aurantiaca były 30 do 65 razy mniej wrażliwe niż D. acidovorans, ze średnimi wartościami MTC między 470 a 1000 µg/L. Pozostałe szczepy bakterii i drożdże Pichia anomala nie reagowały na testowany antybiotyk nawet przy najwyższych testowanych stężeniach 1500 µg/L.

Luminescencyjne bakterie A. fischeri i pierwotniaki S. ambiguum używane odpowiednio w testach Microtox® i Spirotox nie reagowały nawet na najwyższe stosowane stężenie OFLX, wynoszące 30 mg/L. Uzyskane wyniki wskazują na brak jakichkolwiek szkodliwych substancji w badanych próbkach innych niż bakteriostatyczny antybiotyk OFLX.

Roztwór OFLX i krople do oczu Floxal naświetlano w symulatorze światła słonecznego SunTest CPS+ przez 120 minut. Stężenie OFLX oznaczano metodą HPLC-DAD. Stężenie OFLX, zarówno w roztworze standardowym, jak i w Floxalu, spadało stopniowo do 60 minut naświetlania, a następnie gwałtownie spadało do kilku procent wartości początkowej. Stężenie OFLX było poniżej granicy oznaczalności (0,05 mg/L) po 120 minutach naświetlania w obu próbkach. Degradacja OFLX w roztworze standardowym była ponad dwa razy szybsza niż w preparacie kropli do oczu, a jej t½ wynosiło 23 minuty w porównaniu do 53 minut.

Względna wrażliwość (RS) wszystkich 11 szczepów użytych w teście MARA, zdefiniowana jako fingerprint, nie zmieniała się podczas pierwszej godziny naświetlania próbek. Stopniowy spadek toksyczności OFLX wobec szczepu nr 6 po 45 i 60 minutach skutkował jedynie względnym wzrostem wartości RS pozostałych szczepów. Po 90 minutach ekspozycji aktywność przeciwbakteryjna znacznie spadła; próbka hamowała wzrost tylko czterech bakterii, podczas gdy po 120 minutach niewielkie hamowanie wzrostu odnotowano tylko dla najbardziej wrażliwego szczepu nr 6.

Na podstawie stężeń OFLX określonych podczas naświetlania i wartości MTC dla poszczególnych szczepów obliczono przewidywane jednostki toksyczności (PTU). Ponieważ tylko trzy szczepy były wrażliwe na próbki do 90 minut naświetlania, wartości PTU obliczono tylko dla D. acidovorans, C. freudii i C. testosteroni. Dla tych samych szczepów obliczono wartości zmierzonych jednostek toksyczności (MTU). W przypadku najbardziej wrażliwej bakterii, D. acidovorans, wartości stężenia OFLX dobrze przewidywały toksyczność próbek, zarówno w roztworze standardowym, jak i w roztworze leku Floxal. Jednak w przypadku C. freudii (obu roztworów) oraz C. testosteroni (Floxal), toksyczność spowodowana przez OFLX stanowiła tylko część całkowitej toksyczności próbek, szczególnie po czasach naświetlania 30 i 45 minut. Wyniki te wskazują na powstawanie toksycznych fotoproduktów dla powyższych organizmów o nieco odmiennym spektrum działania. Różnice między wartościami MTU i PTU zmniejszały się z czasem, co pokazuje fotolabilność powstałych fotoproduktów.

Jakie produkty pojawiają się w wyniku fotodegradacji OFLX?

UHPLC sprzężone z wysokorozdzielczym MS/MS zostało użyte do identyfikacji związków powstałych podczas fotodegradacji OFLX. Na podstawie wyników UHPLC z wysokorozdzielczym MS/MS i wcześniejszej literatury zaproponowano 22 prawdopodobne produkty pośrednie degradacji OFLX. Naświetlany OFLX ulegał różnym zmianom. P347 powstał przez odłączenie grupy metylowej z pierścienia piperazynylowego, podczas gdy P391 powstał przez utlenienie tego pierścienia. Największa liczba różnych pochodnych powstała przez oksydacyjny rozkład pierścienia piperazyny (P363, P349, P348, 319b, P306 i P304) i/lub pierścienia oksazyny (P319a, P289, P275 i P255). Przemiany te doprowadziły do całkowitej degradacji pierścieni piperazyny (P278 i P263) i oksazyny (P225).

Dzięki temu, że analiza UHPLC MS/MS była przeprowadzana w każdym punkcie czasowym, możliwe było śledzenie czasu, w którym pojawiały się poszczególne produkty pośrednie. Najwcześniej w roztworze OFLX pojawiło się P374 (dezmetylofloksacyna). W roztworze Floxal reakcja ta zachodziła później. Jednak po 90 minutach (OFLX) i 120 minutach (Floxal) pochodna ta nie była już obserwowana.

W większości przypadków te same produkty powstawały zarówno w roztworach OFLX, jak i kroplach do oczu Floxal po tym samym czasie ekspozycji. Wyjątkiem były P363, P345 i P100, które powstawały w znacznie większych ilościach w Floxalu po 90 minutach, oraz P319b, P275 i P119, których praktycznie nie było w naświetlanym roztworze Floxal.

Jak OFLX działa przeciwbakteryjnie i co wpływa na jego toksyczność?

W tym badaniu fotodegradacja OFLX została kompleksowo oceniona przy użyciu analizy biologicznej (biotesty) i chromatograficznej. Po raz pierwszy porównano fotodegradację roztworów OFLX przygotowanych w standardowym minimalnym medium mineralnym (medium Tyrode’a) i formulacji kropli do oczu Floxal.

Fluorochinolony są antybiotykami bakteriostatycznymi o szerokim spektrum działania. Ich podstawowy mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy białek poprzez interakcję z gyrazą i topoizomerazą IV. OFLX jest fluorochinolonem drugiej generacji szeroko stosowanym na całym świecie. OFLX i jego S-enancjomer lewofloksacyna należą do najszerzej badanych fluorochinolonów. Ich wysokie stężenie w wodach powierzchniowych dochodzące do 11,7 µg/L, w połączeniu z wysoką toksycznością dla sinic NOEC = 5 µg/L, oznacza, że w ponad 20 publikacjach ich współczynnik zagrożenia (HQ) dla środowiska wodnego przekracza 1. Oznacza to, że stanowią duże zagrożenie dla środowiska.

OFLX ma silne działanie przeciwbakteryjne, szczególnie przeciwko bakteriom Gram-ujemnym. OFLX w stężeniach poniżej 1 mg/L hamował wzrost 7 z 10 szczepów bakterii użytych w teście MARA. Trzy szczepy były szczególnie wrażliwe – D. acidovorans, C. freudii i C. testosterone – dla których średnie wartości MTC wynosiły odpowiednio 12,2, 75,6 i 92,5 µg/L. Te same trzy szczepy bakterii Gram-ujemnych były najbardziej wrażliwe na inne fluorochinolony: cyprofloksacynę, norfloksacynę, pefloksacynę i flerofloksacynę. Na uwagę zasługuje również stosunkowo wysoka aktywność bakteriostatyczna OFLX wobec dwóch szczepów bakterii Gram-dodatnich użytych w teście MARA, K. gibsoni i Microbacterium sp., z wartościami MTC około 500 µg/L. OFLX, ze względu na swoją aktywność bakteriostatyczną, nie jest toksyczny dla bakterii luminescencyjnych. Nasze wyniki potwierdzają wcześniejsze doniesienia Bergheima i wsp., którzy nie stwierdzili toksyczności 6 mg/L lewofloksacyny w krótkoterminowym teście bioluminescencji z V. fischeri.

Nieco niższa toksyczność kropli do oczu Floxal w porównaniu do standardowego roztworu antybiotyku w teście MARA może wynikać z różnych proporcji izomerów w próbkach. OFLX jest mieszaniną dwóch izomerów. S-enancjomer, sprzedawany jako lewofloksacyna, jest kilkakrotnie bardziej aktywny niż racemiczny OFLX. Metodologia analityczna HPLC stosowana w niniejszym badaniu nie umożliwia rozdzielenia izomerów OFLX, a przedstawione wyniki wskazują sumę ich stężeń. Ponieważ OFLX w roztworze standardowym i w kroplach do oczu Floxal pochodził z różnych źródeł, ich skład izomerów może być różny, co może skutkować różną aktywnością przeciwbakteryjną.

Jak promieniowanie wpływa na degradację OFLX?

Fotodekompozycja OFLX zależy od długości fali światła naświetlającego. Ponieważ OFLX nie absorbuje światła o długości fali powyżej 400 nm, nie ulega degradacji w świetle widzialnym. Wymaga więc zastosowania odpowiednich fotokatalizatorów i/lub zastosowania pełnego światła słonecznego, tj. Vis i UV. W naszych badaniach 80% OFLX zostało rozłożone podczas 60-minutowej ekspozycji w symulatorze światła słonecznego SunTest CPS+. Znacznie wolniejszy rozkład zaobserwowali Lu i wsp., którzy użyli monochromatycznego światła LED o długości fali 365 nm. Powodem mogła być znacznie niższa intensywność promieniowania diody LED w porównaniu do lampy ksenonowej użytej w tej pracy. Napromieniowanie w urządzeniu SunTest CPS+ jest w zakresie do 65 W m⁻² (300-400 nm) i 750 W m⁻² (300-800 nm), tj. odpowiada napromieniowaniu światła słonecznego. Degradacja lewofloksacyny w świetle słonecznym była równie szybka jak w naszym eksperymencie, z t½ około 30 minut. Jednak w przypadku OFLX z kropli do oczu Floxal zaobserwowano wolniejszą degradację w pierwszej godzinie naświetlania, a następnie znaczne przyspieszenie w następnej godzinie. Po 90 minutach OFLX został niemal całkowicie zdegradowany fotochemicznie w obu próbkach. Krople do oczu Floxal, oprócz 3 mg/ml OFLX, zawierają roztwór izotonicznej soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i chlorek benzalkonium (25 µg/ml). Dlatego stężenie chlorku benzalkonium w badanym roztworze było ponad 100 razy niższe niż OFLX. Możliwy wpływ soli benzalkoniowych na proces fotodegradacji nie został oceniony w literaturze. Wpływ ten powinien zostać określony w przyszłych badaniach.

Fotoreaktywność fluorochinolonów wynika z wzbudzenia chromoforu chinolonowego po absorpcji fotonu. Ding i wsp., używając różnych quencherów, stwierdzili, że fotokatalityczna degradacja OFLX z użyciem nanocząstek kompozytowych tlenku tytanu/cyrkonu na podłożu z tlenku grafenu była głównie spowodowana rodnikami O₂•−•, podczas gdy HO• odgrywał tylko niewielką rolę. Dhiman i wsp., używając innego fotokatalizatora, również wskazali na pierwszorzędne znaczenie rodników, z mniejszą rolą dziur.

Fotodekompozycja fluorochinolonów przez bezpośrednie napromieniowanie była wcześniej badana. Zaproponowano kilka ścieżek transformacji OFLX pod wpływem napromieniowania, w tym (1) hydroksylację; (2) hydroksylację z otwarciem pierścienia oksazyny; (3) rozszczepieniem pierścienia piperazyny; (4) defluorowanie; i (5) demetylację. Analiza napromieniowanych próbek za pomocą UHPLC z wysokorozdzielczym MS/MS ujawniła obecność 22 substancji, których powierzchnie pików były ponad 10 razy większe niż w próbkach nienapromieniowanych. Zidentyfikowane fotoprodukty OFLX dobrze zgadzały się z wcześniejszymi badaniami nad fotodegradacją OFLX. Podobnie jak w badaniach Frąckowiaka i Li, zaobserwowano pochodne wynikające głównie z rozkładu pierścienia piperazyny i oksazyny. Atom N-aminowy w pierścieniu piperazyny jest łatwo utleniany, dając początek serii utlenionych (P391) i otwierających pierścień pośrednich (P363, P306 i P304, i P278) i ostatecznie rozszczepieniu całego pierścienia piperazyny (P263). Podobnie jak w badaniach Lu i wsp., Li i Xing i wsp., zaobserwowano również defluorowanie i dekarboksylację.

Czy fotodegradacja OFLX wpływa na strukturę i aktywność przeciwbakteryjną?

Nowością naszych badań jest analiza produktów po różnych czasach fotodegradacji. Ze względu na brak standardów analitycznych nie było możliwe ocenić ich stężeń. Jednak na podstawie wielkości obszarów pod pikiem można było oszacować trendy zmian w czasie. Zaobserwowano pochodne, które pojawiały się zarówno bezpośrednio po 30 minutach naświetlania (P347 i P319a), jak i na końcu procesu (P255 i P249). W kilku przypadkach zaobserwowano znaczące różnice w zawartości niektórych pośrednich produktów, przy czym OFLX w Floxalu wykazywał silniejszy rozkład pierścienia piperazyny (P363 i P345), podczas gdy OFLX w czystym roztworze silniej defluorował (P319b i P275). Różne tempo powstawania różnych pochodnych obserwowane dla roztworu OFLX i kropli do oczu Floxal może wynikać z dwóch powodów. Po pierwsze, różne proporcje izomerów degradowane różnymi ścieżkami transformacji. Po drugie, w preparacie leku obecny był chlorek benzalkonium, którego wpływ na fotodegradację fluorochinolonów nie jest znany.

Kluczowymi elementami cząsteczki dla bakteriostatycznego działania fluorochinolonów są pozycja N1 podstawiona małą grupą hydrofobową oraz grupy 3-karboksylowa i 4-karbonylowa. Atom fluoru w pozycji 6 determinuje wysoką skuteczność działania przeciwbakteryjnego. Z kolei podstawnik w pozycji 7 oddziałuje z gyrazą DNA i topoizomerazą IV, a jego typ determinuje siłę interakcji z różnymi szczepami bakterii.

Fluorochinolony stanowią bardzo dużą i stale rozszerzającą się grupę antybiotyków. Jednak niewiele wiadomo o toksyczności i aktywności przeciwbakteryjnej ich produktów transformacji. Dezmetylofloksacyna (znana również jako zanieczyszczenie E ofloksacyny) ma umiarkowaną aktywność przeciwbakteryjną, podczas gdy N-tlenek ofloksacyny ma tylko minimalną aktywność. Produkty degradacji P391, P363, P349, P348, P347, P345, P306 i P304 zidentyfikowane w tym badaniu zachowały podstawowe elementy, które determinują aktywność przeciwbakteryjną wymienioną powyżej. W ich przypadku zmiany pod wpływem światła były związane głównie z podstawnikiem piperazyny. Stąd te produkty transformacji mogą zachować częściową aktywność przeciwbakteryjną i mogą być odpowiedzialne za większą aktywność niż aktywność OFLX przeciwko bakteriom w teście MARA, którą zaobserwowano podczas naświetlania próbek. Toksyczność produktów fotodegradacji określono pośrednio, porównując wartości MTU z wartościami PTU, które obliczono na podstawie stężenia OFLX w próbce. Bergheim i wsp. stwierdzili, że toksyczność próbek lewofloksacyny w teście toksyczności przewlekłej na Pseudomonas putida spadała podczas naświetlania, ale wolniej niż zawartość antybiotyku. Zhang i wsp., badając proces biotransformacji cyprofloksacyny, zaobserwowali transformacje podobne do procesu fotodegradacji: hydroksylację, dekarboksylację i rozkład pierścienia piperazyny. Zaobserwowali wysoką aktywność przeciwbakteryjną zarówno antybiotyku, jak i jego produktów transformacji przeciwko Escherichia coli i Bacillus subtilis.

Jakie konsekwencje dla zdrowia i środowiska niesie fotodegradacja OFLX?

Fotodegradacja OFLX prowadzi do powstawania substancji o niskiej toksyczności z toksycznymi efektami na organizmy eukariotyczne. Stąd w badaniu transformacji związków przeciwbakteryjnych konieczne jest również stosowanie innych bioassayów, które nie są używane tylko do określonego celu. Dodatkowe organizmy powinny pochodzić z różnych grup taksonomicznych, co może być związane z ich reakcją na związki chemiczne o różnych strukturach. Takie działanie może pozwolić na uchwycenie innych, nieoczekiwanych efektów testowych, na przykład mutagenności i indukcji oporności mikroorganizmów na bakteriostatyczne działanie związków.

Obecne badania wykazały, że proces fotodegradacji OFLX w minimalnym medium i w formulacjach kropli do oczu jest bardzo podobny. Przyszłe badania powinny ocenić fotodegradację OFLX rozpuszczonego w różnych wodach powierzchniowych. Umożliwi to ocenę wpływu substancji, które zarówno spowalniają fotodegradację (zmiatacze), jak i/lub przyspieszają ją (np. kwasy humusowe).

Fotodegradacja OFLX prowadzi do powstawania substancji o niskiej toksyczności z toksycznymi efektami na organizmy eukariotyczne. Stąd w badaniu transformacji związków przeciwbakteryjnych konieczne jest również stosowanie innych bioassayów, które nie są używane tylko do określonego celu. Dodatkowe organizmy powinny pochodzić z różnych grup taksonomicznych, co może być związane z ich reakcją na związki chemiczne o różnych strukturach. Takie działanie może pozwolić na uchwycenie innych, nieoczekiwanych efektów testowych, na przykład mutagenności i indukcji oporności mikroorganizmów na bakteriostatyczne działanie związków.

Podsumowanie

Ofloksacyna jest drugim najpopularniejszym antybiotykiem z grupy fluorochinolonów w USA, szczególnie często stosowanym w okulistyce. Badania wykazały, że OFLX ulega fotodegradacji pod wpływem światła UV-Vis, przy czym proces ten jest wolniejszy w przypadku kropli do oczu Floxal niż czystej substancji. W czasie 120-minutowej ekspozycji na światło zidentyfikowano 22 produkty degradacji, powstające głównie w wyniku rozkładu pierścienia piperazyny i oksazyny. Degradacja OFLX w roztworze standardowym zachodziła ponad dwukrotnie szybciej niż w kroplach do oczu. Niektóre z powstałych produktów zachowały częściową aktywność przeciwbakteryjną, szczególnie wobec bakterii Gram-ujemnych. Badania wykazały, że fotodegradacja nie prowadzi do powstawania substancji ostro toksycznych dla organizmów eukariotycznych, jednak obecność OFLX w środowisku wodnym może stanowić zagrożenie ze względu na możliwość indukcji oporności mikroorganizmów na antybiotyki.

Bibliografia

Nałęcz-Jawecki Grzegorz, Mielniczek Jakub, Wawryniuk Milena, Giebułtowicz Joanna and Drobniewska Agata. The Microbial Assay for Risk Assessment (MARA) in the Assessment of the Antimicrobial Activity of Ofloxacin and Its Photoproducts. International Journal of Molecular Sciences 2025, 26(6), 265-298. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms26062595.